血清素（5-羟色胺，5HT）作为关键神经递质，其水平异常与抑郁症、焦虑症等神经系统疾病密切相关。传统检测方法面临灵敏度低、选择性差的挑战，而单壁碳纳米管（SWCNT）因近红外（NIR-II，1000-1700 nm）荧光特性，穿透深度高且背景干扰低，成为生物传感器的理想材料。单链DNA（ssDNA）包裹的SWCNT（ssDNA-SWCNT）可通过荧光变化响应目标分子，但天然序列的传感性能需优化。

一、核心技术框架

1.1 定向进化原理

模拟自然选择过程，对ssDNA序列进行人工突变与筛选，目标是获得对5HT响应更优的ssDNA-SWCNT复合物。该方法突破传统蛋白质工程局限，首次应用于核酸-纳米材料复合体系。

图1：(a) 借助机器学习模型的定向进化。在定向进化过程中应用机器学习模型，以预测可能展现出更优传感器响应的序列。(b) 基于机器学习筛选的血清素（5 - 羟色胺，5HT）响应型单链 DNA - 单壁碳纳米管（ssDNA-SWCNT）纳米传感器定向进化方案。

1.3 高通量筛选逻辑

每轮突变产生22,032种序列，ML模型预测后选取top 20序列实验验证，替代传统全样本测试，将筛选效率提升超1000倍。

二、分阶段优化

2.1 第一阶段：灵敏度优化（3轮定向进化）

第1轮：初始序列与突变设计

图2：用于定向进化的单链 DNA（ssDNA）序列及预测得分：（a）原始序列的 3 碱基突变序列示例。每轮通过机器学习模型测试 22,032 条突变序列，突变碱基以红色高亮显示。（b）第一轮中所有 22,032 条突变序列的机器学习模型预测 ΔF/F₀均值图（按降序排列）。ΔF/F₀定义为添加 5HT 后荧光强度的增加比例。（c）机器学习模型预测 ΔF/F₀蕞高的前 20 条序列。

起始序列：选用前期研究中对5HT有响应的30-mer ssDNA（5′-CCCCCCAGCCCTTCACCACCAACTCCCCCC-3′）。突变策略：对中心18个碱基进行3碱基随机突变（两侧各保留6个连续C碱基），生成22,032种突变序列。ML筛选：通过集成模型预测ΔF/F₀，选取top 20序列合成，实验验证后最佳序列为N1-12，ΔF/F₀达2.366（原始序列0.949），提升2.5倍。

图3. 针对灵敏度的三轮定向进化。(a) 原始序列 ssDNA-SWCNT 复合物溶液在添加和未添加 5HT 时的荧光光谱。ΔF/F₀由 1202 nm 处的荧光强度计算得出，并用作灵敏度的衡量标准。(b) 测试序列的实验 ΔF/F₀值图。N1-12、N2-1 和 N3-5 分别标记了第 1、2 和 3 轮中的最佳性能值。请注意，最佳性能 ΔF/F₀值随着轮次的增加而增加。(c) 每轮中最佳性能序列和原始序列的 ΔF/F₀值。* 表示 p < 0.05 时的统计显著结果，n.s. 表示 p > 0.05 时的非统计显著结果。当 N3-5 与 N2-1 进行 t 检验时无统计学意义，因此进化在第 2 轮时已饱和。(d) 标准化 ΔF/F₀作为 5HT 浓度函数的校准曲线。每条校准曲线分别代表原始（蓝色）、N1-12（橙色）、N2-1（绿色）和 N3-5（红色）序列的 ssDNA-SWCNT。每个浓度（0.1 至 100 μM）的实验均重复三次。(e) 灵敏度实验中每轮的蕞佳性能序列。

第2轮：以N1-12为模板迭代

突变库规模同上，ML预测后实验验证，蕞佳序列N2-1的ΔF/F₀提升至3.705，解离常数（Kd）从原始序列的11.6 μM降至10.7 μM。

第3轮：饱和优化

以N2-1为模板，筛选出N3-5序列，ΔF/F₀达3.765，但与N2-1无统计学差异，表明灵敏度优化进入平台期。

2.2 第二阶段：选择性优化（2轮定向进化）

挑战：结构相似性干扰

5HT与多巴胺（DA）结构相似，传统传感器存在交叉响应，需以5HT/DA荧光响应比（5HT/DA = ΔF₅HT/F₀ ÷ ΔF_DA/F₀）为指标优化。

图 4. 针对选择性的两轮定向进化。(a) 原始序列 ssDNA-SWCNT 复合物溶液在添加和未添加多巴胺（DA）时的荧光光谱。(b) 原始序列 ssDNA-SWCNT 复合物溶液在添加和未添加 5HT 时的荧光光谱。(c) 按升序排列的全序列选择性值图。选择性通过 5HT 与 DA 的 ΔF/F₀比值（5HT/DA）计算，即 (ΔF₅HT/F₀)/(ΔF_DA/F₀)。L1-14 和 L2-16 分别表示第一轮和第二轮的最佳性能值，可见第二轮性能较第一轮降低。(d) 每轮蕞佳性能序列与原始序列的 5HT/DA 值。* 表示 p<0.05 时的统计显著结果，n.s. 表示 p>0.05 时的非统计显著结果。L2-16 与 L1-14 进行 t 检验时具有统计学意义，但因性能低于 L1-14，表明选择性优化在第一轮已达饱和。(e) 针对 100 μM 5HT 的 ΔF/F₀，测试 100 μM 乙酰胆碱（Ach）、γ- 氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）、抗坏血酸（AA）和 10 μM 尿酸（UA）的 ΔF/F₀值。实验采用原始序列和 L1-14 序列，每种分析物重复三次。(f) 选择性实验中每轮的蕞佳性能序列。

第1轮：初始选择性筛选

以原始序列为模板突变，ML模型同时预测5HT和DA的ΔF/F₀，计算5HT/DA比值。蕞佳序列L1-14的5HT/DA比为0.799，较原始序列（0.508）提升1.6倍。

第2轮：L1-14模板迭代

筛选出N2-6序列，5HT/DA比0.592，但性能低于L1-14，表明选择性优化在第1轮已接近饱和。

2.3 实验验证体系  

ssDNA-SWCNT复合物制备

1.0 mg ssDNA与1.0 mg SWCNT混合于1×PBS，浴超声3分钟后，冰浴探头超声20分钟（50%振幅）。21,000×g离心1小时，取上清稀释100倍，通过632 nm吸光度计算浓度（消光系数0.036 mg·L⁻¹·cm⁻¹）。

荧光响应检测

图5. N2-1传感器的荧光图像及荧光随时间变化分析。（a,b）玻璃盖玻片表面固定的N2-1传感器在5HT处理前后的荧光图像（比例尺：10微米）。（c）多个传感器区域的荧光强度随时间变化曲线，箭头所示为注射5HT的时间点。（荧光图像由英国 Raptor Photonics 公司的NINOX 640 相机，通过 950 nm 长通滤光片采集。）

灵敏度测试：在1195 nm监测5HT（0.1-100 μM）诱导的ΔF/F₀变化。选择性测试：在1202 nm对比5HT、DA、乙酰胆碱等分子的荧光响应，计算5HT/DA比值。

2.4 表面固定化功能验证

APTES修饰玻璃基底吸附SWCNT，成像腔中加入100 μM 5HT，NINOX 640相机通过950 nm长通滤镜记录荧光变化，1分钟内ΔF/F₀提升40%。

三、研究结果

灵敏度突破：3轮优化后，N2-1序列的ΔF/F₀达3.705（原始0.949），Kd降至6.6 μM，结合力显著增强。选择性提升：L1-14序列的5HT/DA比达0.799（原始0.508），对其他神经递质（如GABA、乙酰胆碱）几乎无响应。实际应用潜力：表面固定化传感器在5HT刺激下荧光稳定增强，为神经细胞原位监测提供可行性。

四、研究意义

方法学创新：首次将ML集成到ssDNA-SWCNT定向进化中，建立“预测-筛选-验证”的高通量开发范式，相比传统随机筛选效率提升超1000倍。材料设计启示：发现A碱基突变在灵敏度（N2-1）和选择性（L1-14）优化中的关键作用，为后续序列工程提供理论依据。临床转化价值：近红外荧光特性适配生物组织深层成像，高灵敏/选择性传感器可用于帕金森病、抑郁症等疾病的血清素动态监测。

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